食品微生物之檢驗方法－生菌數之檢驗
101年11月19日署授食字第1011902832號公告
1. 適用範圍：本方法適用於食品中生菌數之檢驗。
2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以平板計數培養基培養及計數之方法。
2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過 15 C FU／培養皿。
2.2. 器具及材料
2.2.1. 乾熱滅菌器。
2.2.2. 高壓滅菌釜。
2.2.3. 冰箱：能維持5 ± 3℃ 者。
2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差 ± 1.0℃ 以內者。
2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差 ± 1.0℃ 以內者。
2.2.6. 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無菌操作者。
2.2.7. 天平：可稱量到 2000 g ，靈敏度為 0.1 g ；可稱量到 120 g ，靈敏度為5 mg。
2.2.8. 旋渦混合器（Vortex mixer）。
2.2.9. 酸鹼度測定儀（pH meter）。
2.2.10. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。
2.2.11. 吸管輔助器（Pipette aid）。
2.2.12. 吸管（Pipette）：已滅菌。 1 m L吸管應有 0.01 m L之刻度； 5 m L及 10 m L吸管應有 0.1 m L刻度。
2.2.13. 培養皿：已滅菌，內徑約 90 mm ，深度約 15 mm ，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
2.2.14. 稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、 99 m L及 90 m L標記附蓋（栓）之可滅菌廣口瓶。
2.2.15. 藥勺、剪刀、小刀、壓舌板及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。
2.2.16. pH試紙：範圍6-8。
2.2.17. 試藥：氯化鈉、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氫氧化鈉、葡萄糖（glucose）及油酸聚醇山梨酯（polysorbate 80, Tween 80）均採用試藥級；蛋白腖（peptone）、胰化蛋白腖（tryptone）、酵母抽出物（yeast extract）及洋菜（agar）均採用微生物級。
2.2.18. 1N氫氧化鈉溶液之配製：
稱取氫氧化鈉 4 g ，加入無菌水溶解使成100 mL。
2.2.19. 稀釋液之配製：
2.2.19.1. 生理食鹽水：
取氯化鈉8.5 g，溶於蒸餾水 1000 m L中，分裝於稀釋用容器中，經 121℃ 滅菌15分鐘。
2.2.19.2. 磷酸鹽緩衝液（Butterfield's phosphate-buffered dilution water）：
取磷酸二氫鉀 34 g ，溶於蒸餾水500 mL，以1N氫氧化鈉溶液調整pH值為7.2，再加蒸餾水使成1000 mL，以121℃ 滅菌15分鐘，貯存於冰箱中，作為原液。使用時，取原液1.25 mL，加入蒸餾水使成1000 mL，分裝於稀釋用容器中，以 121℃ 滅菌15分鐘。
2.2.19.3. 0.1%蛋白腖稀釋液（0.1% peptone diluent）：
取蛋白腖 1 g ，溶於蒸餾水使成1000 mL，分裝於稀釋用容器中，經 121℃ 滅菌15分鐘，最終pH值為7.0 ± 0.1。
2.2.20. 平板計數培養基（Plate count agar, PCA），亦稱標準方法培養基（Standard method agar）
胰化蛋白腖（tryptone）........................................................................................ 5 g
酵母抽出物（yeast extract）.............................................................................. 2.5 g
葡萄糖（glucose）................................................................................................. 1 g
洋菜（agar）........................................................................................................ 15 g
蒸餾水.............................................................................................................. 1000 mL
加熱溶解後，分裝於適當之容器中，經 121℃ 滅菌15分鐘，最後pH值為7.0 ± 0.2。
2.3. 檢液之調製
2.3.1. 固態檢體：將檢體切碎混合均勻後，取 50 g ，加入稀釋液450 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。
2.3.2. 粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體：以已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後，混合均勻，取 50 g ，以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.3. 液態檢體：將檢體振搖均勻混合，取 50 m L，作為原液，以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.4. 冷凍檢體：須解凍者，如冷凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等，應在冷藏之溫度下解凍（如2～ 5℃ ，18小時內即可解凍完全）；亦可使用較高溫度快速解凍（置於 45℃ 以下之水浴中，可在15分鐘內解凍之檢體適用之）。解凍時應經常搖動檢體，以加速解凍。俟檢體解凍後，再予以切碎並混合均勻。不須解凍者，如食用冰塊、冰棒等冰類製品，應速先行使成適當小塊；再依 2.3.1 .節，製成10倍稀釋檢液。如檢驗工作無法立即進行，應將檢體貯存於 -20℃ 。
2.3.5. 凝態及濃稠液態檢體：如布丁、煉乳、海苔醬等，經攪拌均勻後，取 50 g ，以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.6. 系列稀釋檢液：使用已滅菌之吸管，吸取上述之10倍稀釋檢液 10 m L加至稀釋液 90 m L中，依序作成100倍、1000倍、10000倍等一系列稀釋檢液，其稀釋方法如下圖所示。
註：1. 除肉製品使用0.1%蛋白腖稀釋液外，其他檢體以磷酸鹽緩衝液作為稀釋液，其次為生理食鹽水。
2. 檢體總量不足50 g（mL）時，應依檢體量，添加適量之稀釋液，作成10倍稀釋檢液。
3. 處理含油脂量多，不易勻散及易起泡沫之檢體時，應加入適量已滅菌之乳化劑（如Tween 80，使其於檢液中濃度為1%），並充分振搖，使之乳化。
2.4. 生菌之培養
2.4.1. 將稀釋檢液及（或）原液充分振搖，混合均勻。
2.4.2. 各吸取各稀釋檢液及（或）原液 1 m L分別置入培養皿中，各檢液至少做二重複。
2.4.3. 另吸取稀釋液 1 m L置入培養皿中，作為空白對照組（二重複）。
2.4.4. 2.4.2.節及2.4.3.節之各培養皿中倒入冷卻至45 ± 1℃ 之平板計數培養基（PCA）12～15 mL，搖動混合，自檢液之調製至此步驟應於15分鐘內完成。
2.4.5. 將 2.4.4 .節之培養基平板靜置，待培養基凝固後，倒置於 35℃ 培養48 ± 2小時。
2.5. 生菌之計算
2.5.1. 經培養後，選取25～250個菌落之兩個平板來計數，其生菌數之表示方式為CFU/g或CFU/mL。
2.5.2. 若各稀釋倍數中僅有一種稀釋倍數平板之菌落數為25～250個，則應以該稀釋倍數之兩個平板之菌落數平均值乘其稀釋倍數，即得其生菌數（附表：樣品編號1）；但若有兩種稀釋倍數之平板之菌落數在25～250個之間時，則應依下列公式計算之，但生菌數結果表示時應將該數字第三位數字四捨六入（當第三位數字為五時，遇第二位數字為奇數時進位，偶數時捨去），使其有效數為兩位。（附表：樣品編號2）。
生菌數（CFU/g或CFU/mL）＝ 
Aa、Ab：A稀釋倍數各平板內之菌落數。
Ba、Bb：B稀釋倍數各平板內之菌落數。
A、B：稀釋倍數。
2.5.3. 各稀釋倍數之菌落數均小於25個時，則以最低稀釋倍數之兩個平板菌落數平均值乘其稀釋倍數。並註明其為估計值（附表：樣品編號3）。
2.5.4. 平板中菌落數大於250個時，則先計數平板中菌落分佈其代表性之一部份，再計算生菌數，而以估計值表示（附表：樣品編號4）。
2.5.5. 擴散菌落，擴散菌落可分為3種形式：
(1) 鏈狀菌落，不能明顯分離，似乎由一堆細菌分裂生長而成。
(2) 細菌生長介於培養基及培養皿底部間之一層水氣中。
(3) 細菌生長於培養基邊緣或表面上之一層水氣上。
2.5.5.1. 平板內產生擴散菌落時應以下述之方法計數。（附表：樣品編號5）擴散菌落所覆蓋面積（包括被擴散菌落造成之抑制生長範圍）超過整個平板面積之1/2時或者被擴散菌落造成之抑制生長範圍超過1/4時，應不予計數，而記錄為’’擴散菌落’’。
2.5.5.2. 擴散菌落形成鏈狀時，若僅一條則應視為一個菌落，若有兩條以上存在時，應視其鏈源處之不同，分別計數之。若為彼此分開而形成大菌落時，亦應予以計數。
2.5.6. 各稀釋倍數均無菌落生長者，則生菌數應小於1乘以最低稀釋倍數並註明估計值（附表：樣品編號6）。
2.5.7. 若二重複平板之菌落數，其中一片在25～250個之間，另一片大於250個時，兩者均應計數（附表：樣品編號7）。
2.5.8. 若二稀釋倍數之菌落數，各有一片在25～250個之間，另一片大於250個或小於25個時，四片皆計數，並依 2.5.2 .節公式計算之（附表：樣品編號8）。
2.5.9. 當二稀釋倍數之菌落數，其中1稀釋倍數之2重複平板之菌落數均在25～250之間，另1稀釋倍數之2重複平板之菌落數，一片在25～250之間，另一片大於250個或小於25個時，四片皆計數，並依公式計算之（附表：樣品編號9及10）。
2.5.10. 確證被污染者或依其他理由認為不適當者，應不得計算之。
附表 生菌數計算舉例說明（2平板／稀釋倍數）
2.6. 檢驗流程圖
2.7. 可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或鑑定系統，惟檢驗結果有爭議時，應以本檢驗方法為準。
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