2014年4月30日 星期三

食品微生物之檢驗方法-大腸桿菌群之檢驗

行政院衛生署公告:訂定「食品微生物之檢驗方法-大腸桿菌群之檢驗」,自即日生效(101.11.19)

行政院衛生署公告中華民國1011119
署授食字第1011902820
主  旨:訂定「食品微生物之檢驗方法-大腸桿菌群之檢驗」,並自即日生效。
依  據:食品衛生管理法第二十五條。
署  長 邱文達
     本案依分層負責規定授權局長決行
 
食品微生物之檢驗方法-大腸桿菌群之檢驗
1011119日署授食字第1011902820號公告
1. 適用範圍:本方法適用於食品中大腸桿菌群之檢驗。
2. 檢驗方法:檢體經系列稀釋後,以三階三支進行培養,配合MPN計數之方法。
2.1. 工作環境:工作平台須寬敞、潔淨、光線良好,操作平台光度為100呎燭光以上,密閉室內換氣良好,儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過 15 C FU/培養皿。
2.2. 器具及材料
2.2.1.  乾熱滅菌器
2.2.2.  高壓滅菌釜。
2.2.3.  冰箱:能維持5 ± 3 者。
2.2.4.  培養箱:能維持內部溫度溫差 ± 1.0 以內者。
2.2.5.  水浴:能維持水溫溫差 ± 0.2 以內者。
2.2.6.  攪拌均質器Blender或鐵胃Stomacher:能適用於無菌操作者。
2.2.7.  天平:可稱量到 2000 g ,靈敏度為 0.1 g ;可稱量到 120 g ,靈敏度為5 mg
2.2.8.  精密天平:靈敏度為 0.001 g 
2.2.9.  酸鹼度測定儀pH meter
2.2.10.吸管輔助器Pipette aid
2.2.11.稀釋用容器:無菌袋或有1000 mL500 mL 99 m L 90 m L標記附蓋之可滅菌廣口瓶。
2.2.12.試管:15 × 150 m m試管或其他適用者。
2.2.13.發酵管Durham fermentation tube:內徑7 × 20 m m或其它適當規格,使用時倒置於15 × 150 m m之試管內。
2.2.14.接種針及接種環直徑約3 mm:鎳鉻合金,鉑銥或鉻線材質,或可拋棄式者。
2.2.15.吸管Pipette:已滅菌。 1 m L吸管應有 0.01 m L之刻度; 5 m L 10 m L吸管應有 0.1 m L刻度。
2.2.16.試藥:氯化鈉、磷酸二氫鉀KH2PO4、磷酸氫二鉀K2HPO4、氫氧化鈉、乳糖lactose、硫酸月桂酸鈉sodium lauryl sulfate、牛膽汁粉末oxgall powder、煌綠brilliant green及油酸聚醇山梨酯polysorbate 80,Tween 80均採用試藥級;胰化蛋白tryptose及蛋白腖peptone採用微生物級。
2.2.17.1N氫氧化鈉溶液之配製:
             稱取氫氧化鈉 4 g ,加入蒸餾水溶解使成100 mL
2.2.18.稀釋液之配製
2.2.18.1. 生理食鹽水:取氯化鈉 8.5 g ,溶於蒸餾水1000 mL,分裝於稀釋用容器中,經 121 滅菌15分鐘。
2.2.18.2. 磷酸鹽緩衝液Butterfield's phosphate-buffered dilution water:取磷酸二氫鉀34 g溶於蒸餾水500 mL,以1N氫氧化鈉溶液調整pH值為7.2,再加蒸餾水使成1000 mL,以 121 滅菌15分鐘,貯存於冰箱中,作為原液。使用時,取原液 1.25 m L加入蒸餾水使成1000 mL,分裝於稀釋用容器中,以 121 滅菌15分鐘。
2.2.18.3. 0.1%蛋白腖稀釋液0.1% peptone diluent:取蛋白腖 1 g ,溶於蒸餾水使成 1000 mL,分裝於稀釋用容器中,經121 滅菌15分鐘,最終pH值為7.0 ± 0.1
2.2.19.培養基
2.2.19.1. 硫酸月桂胰化蛋白培養液Lauryl sulfate tryptose broth, LST
              
2.2.19.2. 煌綠乳糖膽汁培養液Brilliant green lactose bile broth, BGLB
                        
2.3. 檢液之調製
2.3.1.  固態檢體:將檢體切碎混合均勻後,取 50 g ,加入稀釋液450 mL,混合均勻,作為10倍稀釋檢液。
2.3.2.  粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體:使用已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後,混合均勻,取 50 g ,以下步驟同2.3.1 .節之操作。
2.3.3.  液態檢體:將檢體振搖均勻混合,取 50 m L,作為原液,以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.4.  冷凍檢體:須解凍者,如冷凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等,應在冷藏之溫度下解凍2 5 18小時內即可解凍完全;亦可使用較高溫度快速解凍置於 45 以下之水浴中,可在15分鐘內解凍之檢體適用之。解凍時應經常搖動檢體,以加速解凍。俟檢體解凍後,再予以切碎並混合均勻。不須解凍者,如食用冰塊、冰棒等冰類製品,應速先行使成適當小塊;再依 2.3.1 .節,製成10倍稀釋檢液。如檢驗工作無法立即進行,應將檢體貯存於 -20 
2.3.5.  凝態及濃稠液態檢體:如布丁、煉乳、海苔醬等,經攪拌均勻後,取 50 g ,以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.6.  系列稀釋檢液:使用已滅菌之吸管,吸取上述之10倍稀釋檢液 10 m L加至稀釋液 90 mL中,依序作成100倍、1000倍、10000倍等一系列稀釋檢液,其稀釋方法如下圖所示。
2.4. 鑑別試驗
2.4.1.  推定試驗:將稀釋檢液及原液充分振搖、混合均勻後,分別吸取 1 m L接種於己裝有硫酸月桂酸胰化蛋白培養液LST試管中,每稀釋檢液各接種3稱三階三支,自檢液之調製至此步驟應於15分鐘內完成,於 35 培養24 ± 2小時,觀察是否產生氣體;未產生氣體者,繼續培養24小時。若仍無氣體產生,為大腸桿菌群陰性;產生氣體者,為可疑大腸桿菌群陽性。
2.4.2.  確定試驗:由 2.4.1 .節產生氣體之各試管中取一白金耳量培養液,接種於另一支煌綠乳糖膽汁培養液BGLB 35培養24 ± 2小時,觀察是否產生氣體;未產生氣體者,繼續培養24小時,若仍無氣體產生即為大腸桿菌群陰性;產生氣體者,判定為大腸桿菌群陽性。
2.4.3.  最確數(Most probable number, MPN):由 2.4.2 .節煌綠乳糖膽汁培養液(BGLB)確定為大腸桿菌群陽性者推算2.4.1.節各階硫酸月桂酸胰化蛋白培養液(LST)大腸桿菌群陽性之試管數,利用最確數表(如附表),推算大腸桿菌群之最確數(MPN/gMPN/mL)。
           
2.5. 檢驗流程圖
 
2.6. 可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或鑑定系統,惟檢驗結果有爭議時,應以本檢驗方法為準
 

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